骑士团直到1530年才拥有自己的领土，当时大团长菲利普·德·维利耶（fra" philippe de villiers de l"isle ada）占领了马耳他岛（alta）。
该岛是由神圣罗马皇帝查理五世和他的母亲卡斯蒂利亚女王琼娜（een joanna of castile）以西西里国王的身份授予骑士团的，得到了教皇克莱门特七世（pope clent vii）的批准，骑士团因此需遵守《马耳他猎鹰的贡品》（tribute of the altese faln）的条件。
在1565年，骑士们在大团长让·德·瓦莱特（fra" jean de valette，曾在土耳其船上和德拉古特一起划桨）的领导下，成功防御了奥斯曼帝国的围攻，持续了三个多月。
骑士团的舰队在1571年的莱班托海战（battle of lepanto）中对奥斯曼海军力量的最终摧毁做出了贡献，该战役由西班牙国王菲利普二世（kg philip ii of spa）的异母兄弟奥地利的约翰（john of atria）指挥。
宗教改革将西欧分裂为新教和天主教国家，对骑士团也产生了影响。
在包括英格兰、苏格兰和瑞典在内的多个国家，骑士团解散。
在其他国家，如荷兰和德国，部分司法区或指挥部（骑士团的行政区划）经历了新教转变。
这些“约翰骑士团”在德国、荷兰、瑞典以及包括美国和南非在内的许多其他国家存续下来。
骑士团被确立为在任何基督教国家之间的战争中保持中立。
从1651年到1665年，骑士团统治了加勒比海的四个岛屿。
在1651年5月21日，它购买了圣巴瑟米岛（sat barthéley）、圣基督山（sat chrisher）、圣克鲁瓦岛（sat croix）和圣马丁岛（sat art）。
这些岛屿是从刚刚解散的法国外岛公司（pagnie des les de l"aérie）手中购买的。
到1665年，这四个岛屿被出售给了法国西印度公司（french west dia pany）。
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1798年，拿破仑领导法国占领马耳他。
拿破仑要求大团长费迪南德·冯·霍姆佩施·祖·博尔海姆（ferdand von hopesch zu bolhei）允许他的舰船进入港口，补给水和物资。
大团长回复说，每次只能允许两艘外国船只进入港口。
拿破仑意识到这一程序将耗费时间，令他的军队暴露在英国海军上将霍雷肖·纳尔逊（adiral horatio neln）面前，于是立即下令对马耳他发起炮击。
法国士兵于6月11日早晨在七个登陆点登陆马耳他并发动攻击。
经过数小时的激烈战斗，西部的马耳他人被迫投降。
拿破仑与堡垒首都瓦莱塔（valletta）展开谈判。
面对远远强于自己的法国军队和西马耳他的失守，大团长同意投降。
霍姆佩施于6月18日离开马耳他前往的里雅斯特（trieste）。
他于1799年7月6日辞去大团长职务。
骑士们虽然分散，但骑士团依然以减弱的形式存在，并与欧洲各国政府谈判，寻求在德意志中介化过程中重新获得权力。
俄罗斯皇帝保罗一世（paul i）为最多骑士提供了在圣彼得堡（sat petersburg）的庇护，这一举动催生了俄罗斯的骑士医院传统，以及骑士团在俄罗斯帝国骑士团中的认可。
在圣彼得堡的难民骑士们选举保罗沙皇为他们的大团长，这使得他成为霍姆佩施大团长的竞争对手，直到霍姆佩施退位，使保罗成为唯一的大团长。
保罗一世除了天主教大优先区外，还创建了一个“俄罗斯大优先区”，其下有不低于118个指挥部，规模庞大且向所有基督徒开放。
然而，保罗作为大团长的选举从未在天主教教规下得到确认，他实际上是骑士团的事实上的大团长，而非法理上的。
到19世纪初，骑士团因失去在欧洲的优先区而严重削弱。
骑士团收入的仅10来自传统的欧洲来源，其余90由俄罗斯大优先区生成，直到1810年。
这部分体现在1805年至1879年间，骑士团的治理由副官而非大团长负责，直到教皇利奥十三世（pope leo xiii）恢复了大团长职务。
这标志着骑士团作为人道主义和宗教组织的复兴。
1806年9月19日，瑞典政府向骑士团提供了哥特兰岛（gotnd）的主权。
由于这意味着骑士团要放弃对马耳他的主张，骑士团拒绝了这一提议。
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法国占领马耳他的军队将医院骑士团驱逐出境。
在马耳他被夺取与总和平之间的十七年间，“选举一位兄弟首领以履行大团长的职务，从而保持这个主权机构的活力，这一形式上的工作得到了恪守”。
大团长的副手和临时大团长职位由大执事（bailiff）长、索尔提科夫伯爵（unto ltikoff）、乔瓦尼·托马西（giovanni toasi）、德·加维拉（de gaevera）、乔瓦尼·耶·塞特内尔斯（giovanni y centelles）、德·坎迪达（de candida）和科洛雷多伯爵（unt lloredo）担任。
他们的任期持续到保罗皇帝于1801年去世。
《亚眠条约》（treaty of aiens，1802年）要求英国撤出马耳他，马耳他将被恢复给重新建立的圣约翰骑士团，其主权将由所有主要欧洲强国保障，并将在最终和平时确定。
然而，由于英国对该条约的异议，这一安排并未实现。
波拿巴拒绝了英国关于马耳他十年租约的提议，促使英国重新激活对法国海岸的封锁。
英国于5月18日对法国宣战。
1802年的条约从未得到实施。
英国以法国在西印度群岛、意大利和瑞士的帝国主义政策为由恢复了敌对行动。
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1815 年维也纳会议（ngress of vienna）确认失去马耳他。
短暂居住在墨西拿（ssa）、卡塔尼亚（catania）和费拉拉ferrara）后，骑士团的总部于1826年迁至费拉拉，1834年迁至罗马。
位于康多蒂路68号的骑士宫（agistral pace）和阿文蒂诺山（avente hill）上的骑士别墅（agistral vil）享有治外法权。
从1839年到1841年，伦巴第-威尼托（lobardy-veia）和西西里（sicily）的大修道得以恢复。
教皇利奥十三世（pope leo xiii）在1879年恢复了大团长一职，结束了75年的空缺，确认乔瓦尼·巴蒂斯塔·切斯基（giovanni battista ceschi a santa croce）为恢复的马耳他骑士团的首任大团长。
然而，这一时期失去马耳他的领土并未影响骑士团的主动和被动外交权，这在法律上对国际地位的绝对延续具有重要意义，无论之前的领土所有权如何。
最初的医院修会使命成为该骑士团的主要活动，并在 20 世纪变得越来越强大，尤其得益于世界许多国家的大修道院和国家协会所开展的活动的贡献。
第一次世界大战和第二次世界大战期间，医院和慈善活动在大团长卢多维科·奇吉·阿尔巴尼·德拉·罗韦雷（fra" dovi chigi albani del rovere，1931–1951）的领导下大规模展开。
在大团长安杰洛·德·莫雅纳·迪·科隆纳（fra" anlo de ojana di logna，1962–88）和安德鲁·伯蒂（fra" andrew bertie，1988–2008）的领导下，项目得到了扩展。
2013 年 2 月，该骑士团庆祝其获得教皇承认 900 周年，与教皇本笃十六世举行了公众接见，并在圣彼得大教堂由红衣主教塔西西奥·贝尔托内（cardal tarcisio bertone）举行了弥撒。
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骑士团在2016年12月开始经历领导危机，当时阿尔布雷希特·冯·博泽拉杰（albrecht freiherr von boeser）抗议大团长马修·费斯廷（fra" atthew festg）将其解除大总理职务。
博泽拉杰因在缅甸的一个联合慈善项目中发现其他援助团体分发避孕套而被解除职务，该项目旨在帮助性奴隶保护自己免受艾滋病的侵害。
2017年1月，教皇方济各（pope francis）下令恢复博泽拉杰的职务，并要求费斯廷辞职。
方济各还任命了乔瓦尼·贝基乌（giovanni beiu）大主教（后来成为红衣主教）作为他在骑士团的个人代表，边缘化了骑士团的红衣主教赞助人雷蒙德·伯克（rayond burke），直到选出新的大团长。
教皇有效地接管骑士团的举动被一些人视为与传统和骑士团独立性的背离。
2017年5月，骑士团任命玻利维亚政府委员会成员毛罗·贝尔特罗·古铁雷斯（auro bertero gutiérrez）领导其宪法改革进程。
2017年6月，骑士团领导层在年会中穿着便服而非正式的全套军服，打破了传统。
2019年5月，骑士团全章会议首次有三名女性参与62名与会者。
2020年11月1日，教皇方济各任命西尔瓦诺·托马西（silvano toasi）大主教（后来成为红衣主教）取代贝基乌，成为其在骑士团的特别代表，重申了该职务作为其唯一代表的职责。
2022年9月3日，教皇方济各公布了骑士团的新宪法，并对主权委员会进行了临时任命。
他安排于2023年1月25日召开特别全章会议，以便在此期间对他的临时任命进行常规任命。
1月26日，全章会议对主权委员会进行了六年任期的选举，选出了与方济各去年9月任命的四名成员相同的成员，以及他所命名的九名顾问中的六名。
2023年6月19日，教皇方济各任命贾恩弗兰科·基兰达（gianfran ghirnda）红衣主教接替伯克担任骑士团的赞助人。
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